PROGRAMA DE DISCIPLINA
CÓDIGO:	CIB 016	
DISCIPLINA:	EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS	
PRÉ-REQUISITOS:		
CARGA HORÁRIA	TEÓRICA:	60 horas	PRÁTICA:		TOTAL:	60 horas	
CRÉDITO:	TEÓRICA:	04	PRÁTICA:		TOTAL:	04	
PROFESSOR (A):	Abelmon Gesteira e  Paulo Sérgio Monzani 	
		
EMENTA:	Clonagem, expressão e purificação de proteínas heterólogas: A disciplina fornecerá  uma introdução dos principais métodos e aplicações na produção e uso de proteínas recombinantes, expressas em sistemas heterólogos. A disciplina será dividida em aulas práticas e teóricas. A parte teórica abordará as estratégias de clonagem e expressão em diferentes sistemas, além de noções básicas de purificação de proteínas. Na parte prática os discentes terão contato técnicas de desenho de primers e amplificação de genes com o uso de PCR, preparação de células competentes, purificação de DNA, clivagem de DNA com enzima de restrição e ligação de inserto e vetor com DNA ligase, clonagem em vetores de expressão, transformação de bactérias, indução da expressão em E. coli, eletroforese em gel de agarose e poliacrilamida e purificação de proteínas por cromatografia líquida de afinidade.	
OBJETIVOS:	Objetivo geral:
Propiciar aos alunos da pós-graduação o aprendizado prático das técnicas de clonagem, expressão e purificação de proteínas heterólogas em sistemas procarióticos.

Objetivos Específicos:
1.	Desenhar os primers para o gene específico inserindo sítios de restrição que não ocorra no gene.
2.	Amplificar por PCR o gene de interesse.
3.	Eletroforese em agarose e recuperação do DNA em gel de agarose.
4.	Clivar com enzimas de restrição o inserto e o vetor bacteriano.
5.	Realizar a ligação entre vetor e inserto.
6.	Preparar células competentes por cloreto de cálcio.
7.	Transformar células competentes com o produto de ligação.
8.	Selecionar colônias positivas.
9.	Purificar o DNA plasmidial.
10.	Transformar células competentes de expressão.
11.	Induzir a expressão gênica.
12.	Verificar a expressão por eletroforese de proteína – SDS-PAGE.
13.	Lisar as células induzidas por congelamento.
14.	Purificar a proteína de interesse por cromatografia de afinidade.
15.	Discutir técnicas de clonagem e expressão em sistemas eucariotos.
	
METODOLOGIA:	Serão Utilizadas Estratégias De Ensino Diversificadas: Aulas Expositivas, Seminários, Aulas Práticas E Uso De Bioinformática Na Internet.	
AVALIAÇÃO:	Serão Avaliados O Interesse Pelas Aulas, A Participação Nas Discussões, A Proposição De Questões Sobre Os Temas Da Disciplina, O Desempenho Nas Avaliações Em Apresentações De Seminário E Nas Atividades Práticas.	
CONTEÚDO PROGRAMÁTICO:
	1.	Sistemas de clonagem e expressão procarióticos.
2.	Sistemas de clonagem e expressão eucarióticos.
3.	Técnicas de clonagem, expressão e purificação de proteínas.

REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA:	Bibliografia Básica:
Sambrook, J. Fritsch, E. Maniats, T. Molecular cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring harbor Press, New York, 1989.

pET Manual System. Novagen, 2000.

GST, Gene Fusion System. Amersham Pharmacia Biotech, 1997.

PMAL Protein Fusion and Purification System Instruction Manual. New England Biolabs, 2000.

IMPACT – CN Instruction Manual. New England Biolabs, 2000.

Periódicos: 

An efficient system for small protein expression and refolding. Biochemical and Biophysical Research Comunications, 317 (2), 401-405, 2004.

The expression of biologically active human p53 in Leishmania cells: a novel eukaryotic system to produce recombinant proteins. Nucleic Acids Research, 23 (20), 4073-4080, 1995.

High-throughput optimization of protein expression in the baculovirus system based on determination of relative expression efficiency of viral stocks. Analytical Biochemistry, 328, 98-100, 2004.

Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system. Protein Expression & Purification, 40 (2), 237-243, 2005.

High-level expression of a novel amine-synthesizing enzyme, N-substituted formamide deformylase, in Streptomyces with a strong protein expression system. Protein Expression & Purification, 40 (1), 212-219, 2005.

High level production and one-step purification of biologically active ectodysplasin A1 and A2 immunoadhesins using the baculovirus/insect cell expression system. Protein Expression & Purification, 37 (1), 162-169, 2004.

Production of recombinant human type I procollagem trimers using a four-gene expression system in the yeast Saccharomyces cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 275 (30)23303-23309, 2000.

Ramanos, M. Advances in the use of Pichia pastoris for high level gene expression. Curr. Opin. Biotech. 6, 527-533, 1995.